人一氧化氮(NO)ELISA试剂盒
(用于血清、血浆、组织匀浆、细胞培养上清液和其它生物体液内)
一、原理
本实验采用双抗体夹心 ABC-ELISA法。用抗人 NO 单抗包被于酶标板上，标准品和样品中的 NO与单抗结合，加入生物素化的抗人NO，形成免疫复合物连接在板上，辣根过氧化物酶标记的Streptavidin与生物素结合，加入底物工作液显蓝色，最后加终止液硫酸，在450nm处测OD值，NO浓度与OD值成正比，可通过绘制标准曲线求出标本中NO浓度。
二、试剂盒组成（2-8℃保存）
酶标板（Coated Wells） | 96孔 | 酶标抗体工作液（Enzyme Conjugate） | 12ml |
10×标本稀释液（Sample Buffer） | 12ml | 20×浓缩洗涤液（Wash Buffer） | 50ml |
标准品（Standards）：1000μM | 1瓶 | 底物工作液（TMB Solution） | 12ml |
抗体工作液（Biotinylated Antibody） | 6ml | 终止液（Stop Solution） | 12ml |
三、 准备试剂与收集血样
1.10×标本稀释液用蒸馏水作1:10倍稀释（示例：1ml浓稀释液+9ml蒸馏水）。
2.收集标本：血清、血浆（EDTA、柠檬酸盐、肝素抗凝）、细胞培养上清液、组织匀浆等尽早检测，2-8℃保存48小时；更长时间须冷冻（-20 ℃或-70 ℃）保存，避免反复冻融。
3.标准品液配制：详细的请看纸上说明
4.洗涤液：用重蒸水1:20稀释（示例：1ml浓缩洗涤液加入19ml的重蒸水）
四、检测程序
1.加样：每孔各加入标准品或待测样品100ul，将反应板充分混匀后置37℃40分钟。
2.洗板：用洗涤液将反应板充分洗涤4-6次，向滤纸上印干。
3.每孔加入蒸馏水和一抗体工作液各50ul(空白除外)。将反应板充分混匀后置37℃20分钟。
4.洗板：同前。
5.每孔加酶标抗体工作液100ul。将反应板置37℃10分钟。
6.洗板：同前。
7.每孔加入底物工作液100ul，置37 ℃暗处反应15分钟。
8.每孔加入100ul终止液混匀。
9.30分钟内用酶标仪在450nm处测吸光值。
五、结果计算与判断
1.所有OD值建议减除空白值后再行计算。如空白OD低于0.1，也可以直接计算。
2.以标准品100、50、25、12.5、6.25、3.125、1.56、0 μM为横坐标，OD值为纵坐标，使用软件作图，画出标准曲线。
3.根据样品OD值计算出相应NO含量。软件可以向本公司邮件索取。
六、试剂盒性能
1.灵敏度：最小的NO 检测浓度小于1μM。
2.特异性：可同时检测重组或天然的人NO。不与人其它细胞因子有交叉反应。
3. 重复性：板内、板间变异系数均小于10％。
七、注意事项
1.以上标准孔及待测样品均建议做复孔，每次测定应同时做标准曲线。
2. 洗涤过程很关键。洗涤不充分将导致有误差及OD值错误地升高。
3. 检测时所有试剂都要恢复到室温。板条开封后剩余板条要再封好，保持板条干燥。
4. 试剂盒使用超敏TMB溶液，若显色过深会出现絮状物，属正常现象，不影响结果判读。
5. 说明书中试剂盒组成为96T的量，48T的量应减半！
6. 本试剂盒宜置4oC冰箱保存。仅用于科研，不能用于临床诊断！
点击交流