人成纤维生长因子-21(FGF-21)ELISA试剂盒 (用于血清、血浆、组织匀浆、细胞培养上清液和其它生物体液内) 一、原理: 本实验采用双抗体夹心 ABC-ELISA法。用抗人 FGF-21 单抗包被于酶标板上,标准品和样品中的 FGF-21与单抗结合,加入生物素化的抗人FGF-21,形成免疫复合物连接在板上,辣根过氧化物酶标记的Streptavidin与生物素结合,加入底物工作液显蓝色,后加终止液硫酸,在450nm处测OD值,FGF-21浓度与OD值成正比,可通过绘制标准曲线求出标本中FGF-21浓度。 二、试剂盒组成(2-8℃保存) 酶标板(Coated Wells) | 96孔 | 酶标抗体工作液(Enzyme Conjugate) | 12ml | 10×标本稀释液(Sample Buffer) | 12ml | 20×浓缩洗涤液(Wash Buffer) | 50ml | 标准品(Standards):20ng/ml | 1瓶 | 底物工作液(TMB Solution) | 12ml | 抗体工作液(Biotinylated Antibody) | 6ml | 终止液(Stop Solution) | 12ml |
三、准备试剂与收集血样: 1.10×标本稀释液用蒸馏水作1:10倍稀释(示例:1ml浓稀释液+9ml蒸馏水)。 2.收集标本:血清、血浆(EDTA、柠檬酸盐、肝素抗凝)、细胞培养上清液、组织匀浆等尽早检测,2-8℃保存48小时;更长时间须冷冻(-20 ℃或-70 ℃)保存,避免反复冻融。 3.标准品液配制:取8个1.5ml离心管,管加标本稀释液900ul,第二至第八管加入标本稀释液500ul。在管中加入20ng/ml的标准品溶液100ul置于漩涡混合器上混匀后用加样器吸出500ul,移至第二管。如此反复作对倍稀释,从第七管中吸出500ul弃去。第八管为空白对照。 4.洗涤液:用重蒸水1:20稀释(示例:1ml浓缩洗涤液加入19ml的重蒸水) 四、检测程序: 1.加样:每孔各加入标准品或待测样品100ul,将反应板充分混匀后置37℃40分钟。 2.洗板:用洗涤液将反应板充分洗涤4-6次,向滤纸上印干。 3.每孔加入蒸馏水和抗体工作液各50ul(空白除外)。将反应板充分混匀后置37℃20分钟。 4.洗板:同前。 5.每孔加酶标抗体工作液100ul。将反应板置37℃10分钟。 6.洗板:同前。 7.每孔加入底物工作液100ul,置37 ℃暗处反应15分钟。 8.每孔加入100ul终止液混匀。 9.30分钟内用酶标仪在450nm处测吸光值。 五、结果计算与判断: 1.所有OD值建议减除空白值后再行计算。如空白OD低于0.1,也可以直接计算。 2.以标准品2000、1000、500、250、125、62.5、31.2、0 pg/ml为横坐标,OD值为纵坐标,使用软件作图,画出标准曲线。 3.根据样品OD值计算出相应FGF-21含量。软件可以向本公司邮件索取。 六、试剂盒性能: 1.灵敏度:小的FGF-21 检测浓度小于15pg/ml。 2.特异性:可同时检测重组或天然的人FGF-21。不与人其它细胞因子有交叉反应。 3.重复性:板内、板见变异系数均小于10%。 七、注意事项: 1.以上标准孔及待测样品均建议做复孔,每次测定应同时做标准曲线。 2. 洗涤过程很关键。洗涤不充分将导致度误差及OD值错误地升高。 3. 检测时所有试剂都要恢复到室温。板条开封后剩余板条要再封好,保持板条干燥。 4. 试剂盒使用超敏TMB溶液,若显色过深会出现絮状物,属正常现象,不影响结果判读。 5. 说明书中试剂盒组成为96T的量,48T的量应减半! 6.本试剂盒宜置4oC冰箱保存。仅用于科研,不能用于临床诊断! |