人Nesfatin定量EIA试剂盒使用说明说明书

人Nesfatin定量EIA试剂盒使用说明

 

原理

本实验采用双抗体夹心 ELISA法。用抗人Nesfatin单抗包被于酶标板上，标准品和样品中的 Nesfatin与单抗结合，加入酶标抗体，形成免疫复合物连接在板上，加入酶底物TMB，出现蓝色，加终止液硫酸，颜色变黄，在450nm处测OD值，Nesfatin浓度与OD值成正比，可通过绘制标准曲线求出标本中Nesfatin浓度。

试剂盒组成（2-8℃保存）

酶标板（Coated Wells）	96孔	酶标抗体工作液（Enzyme Conjugate）	6ml
标准品（Standards）：6瓶	一套	20×浓缩洗涤液（Wash Buffer）	50ml
封板纸	一张	底物工作液（TMB Solution）	12ml
坐标纸	一张	终止液（Stop Solution）	12ml

准备试剂与收集血样

1.          收集标本：血清、血浆（EDTA、柠檬酸盐、肝素抗凝）、细胞培养上清液、组织匀浆等尽早检测，2-8℃保存48小时；更长时间须冷冻（-20 ℃或-70 ℃）保存，避免反复冻融。

2.          标准品*次使用时用0.5ml的蒸馏水溶解，放置半小时混匀后使用，用后放在-20^oC保存。溶解后浓度分别为14、8、3.2、1.6、0.8、0ng/ml。

3.          标本如果需要稀释可以用蒸馏水稀释。

4.         洗涤液：用重蒸水1:20稀释（示例：1ml浓缩洗涤液加入19ml的重蒸水）

检测程序

1.          建立标准曲线：设标准孔6孔，每孔各加入标准品50ul。

2.          加样：待测品孔每孔各加入待测样品50ul。

3.          每孔加酶标抗体工作液50ul。将反应板置37℃120分钟。（室温过夜可以提高灵敏度）

4.          洗板：同前。

5.          每孔加入底物工作液100ul，置37 ℃暗处反应15分钟。

6.          每孔加入100ul终止液混匀。

7.          30分钟内用酶标仪在450nm处测吸光值。

结果计算与判断

1.          所有OD值都应减除空白值后再行计算。

2.          以标准品14、8、3.2、1.6、0.8、0 ng/ml为横坐标，OD值为纵坐标，在坐标纸上作图，画出标准曲线。

3.          根据样品OD值在该曲线图上查出相应Nesfatin含量。

试剂盒性能

             1.   灵敏度：zui小的Nesfatin 检测浓度小于0.4ng/ml。

2.        特异性：可同时检测重组或天然的人Nesfatin。不与人其它细胞因子有交叉反应。

3.        重复性：板内、板见变异系数均小于10％。

注意事项

             1.   以上标准孔及待测样品均建议做复孔，每次测定应同时做标准曲线。

 2.   洗涤过程很关键。洗涤不充分将导致度误差及OD值错误地升高。

             3.   板条开封后剩余板条要再封好，保持板条干燥。

             4.   本试剂盒宜置4^oC冰箱保存。

 5.   本试剂盒仅用于科研，不能用于临床诊断！