牛促甲状腺素释放激素（TRH）ELISA试剂盒说明书

 

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牛促甲状腺素释放激素（TRH）ELISA试剂盒
 （用于血清、血浆、细胞培养上清液和其它生物体液内）
 
原理
本实验采用双抗体夹心 ABC-ELISA法。用抗牛 TRH 单抗包被于酶标板上，标准品和样品中的 TRH与单抗结合，加入生物素化的抗牛TRH，形成免疫复合物连接在板上，辣根过氧化物酶标记的Streptavidin与生物素结合，加入底物工作液显蓝色，zui后加终止液，在450nm处测OD值，TRH浓度与OD值成正比，可通过绘制标准曲线求出标本中TRH浓度。
试剂盒组成（2-8℃保存）

酶标板（Coated Wells）	96孔	酶标抗体工作液（Enzyme Conjugate）	12ml
10×标本稀释液（Sample Buffer）	12ml	20×浓缩洗涤液（Wash Buffer）	50ml
标准品（Standards）：500ng/瓶	2瓶	底物工作液（TMB Solution）	12ml
*抗体工作液（Biotinylated Antibody）	12ml	终止液（Stop Solution）	12ml

准备试剂与收集血样
1.          收集标本：血清、血浆（EDTA、肝素抗凝）、细胞培养上清液、组织匀浆等尽早检测，2-8℃保存48小时；更长时间须冷冻（-20℃或-70℃）保存，避免反复冻融。正常标本测定前用标本稀释液至少作1：10稀释（取20ul，加标本稀释液180ul,稀释10倍）。
2.          标准品液配制：使用前加入0.5ml蒸馏水混匀，配成1000ng/ml的溶液。设标准管8管，*管加标本稀释液900ul，第二至第八管加入标本稀释液500ul。在*管中加入1000ng/ml的标准品溶液100ul混匀后用加样器吸出500ul，移至第二管。如此反复作对倍稀释，从第七管中吸出500ul弃去。第八管为空白对照。
3.          10×标本稀释液用蒸馏水作1:10倍稀释（示例：1ml浓稀释液+9ml蒸馏水）。
4.         洗涤液：用重蒸水1:20稀释（示例：1ml浓缩洗涤液加入19ml的重蒸水）
检测程序
1.          加样：每孔各加入标准品或待测样品100ul，将反应板充分混匀后置37℃120分钟。
2.          洗板：用洗涤液将反应板充分洗涤4-6次，向滤纸上印干。
3.          每孔中加入*抗体工作液100ul。将反应板充分混匀后置37℃60分钟。
4.          洗板：同前。
5.          每孔加酶标抗体工作液100ul。将反应板置37℃30分钟。
6.          洗板：同前。
7.          每孔加入底物工作液100ul，置37℃暗处反应15分钟。
8.          每孔加入100ul终止液混匀。
9.          30分钟内用酶标仪在450nm处测吸光值。
结果计算与判断
1.          所有OD值都应减除空白值后再行计算。
2.          以标准品100、50、25、12.5、6.25、3.12、1.56、0 ng/ml为横坐标，OD值为纵坐标，在坐标纸上作图，画出标准曲线。
3.          根据样品OD值在该曲线图上查出相应TRH含量，再乘上稀释倍数即可。
试剂盒性能
             1.   灵敏度：zui小的TRH 检测浓度小于1ng/ml。
2.        特异性：可同时检测重组或天然的牛TRH。不与牛其它细胞因子有交叉反应。
3.        重复性：板内、板见变异系数均小于10％。
注意事项
             1.   以上标准孔及待测样品均建议做复孔，每次测定应同时做标准曲线。
 2.   洗涤过程很关键。洗涤不充分将导致度误差及OD值错误地升高。
             3.   板条开封后剩余板条要再封好，保持板条干燥。
             4.   本试剂盒宜置4^oC冰箱保存。
 5.   本试剂盒仅用于科研，不能用于临床诊断！