人环磷酸鸟苷（cGMP）试剂盒说明书

人环磷酸鸟苷(cGMP)ELISA试剂盒

 

一、原理：

  本实验采用双抗体夹心 ABC-ELISA法。用抗人 cGMP 单抗包被于酶标板上，标准品和样品中的 cGMP与单抗结合，加入生物素化的抗人cGMP，形成免疫复合物连接在板上，辣根过氧化物酶标记的Streptavidin与生物素结合，加入底物工作液显蓝色，后加终止液硫酸，在450nm处测OD值，cGMP浓度与OD值成正比，可通过绘制标准曲线求出标本中cGMP浓度。

二、试剂盒组成(2-8℃保存）：

酶标板（Coated Wells）	96孔	酶标抗体工作液（Enzyme Conjugate）	12ml
10×标本稀释液（Sample Buffer）	12ml	20×浓缩洗涤液（Wash Buffer）	50ml
标准品（Standards）：2nmol/ml	1瓶	底物工作液（TMB Solution）	12ml
抗体工作液（Biotinylated Antibody）	6ml	终止液（Stop Solution）	12ml

三、准备试剂与收集血样:

1. 10×标本稀释液用蒸馏水作1:10倍稀释（示例：1ml浓稀释液+9ml蒸馏水）。
2. 收集标本：血清、血浆（EDTA、柠檬酸盐、肝素抗凝）、细胞培养上清液、组织匀浆等尽早检测，2-8℃保存48小时；更长时间须冷冻（-20 ℃或-70 ℃）保存，避免反复冻融。
3. 标准品液配制：取8个1.5ml离心管，管加标本稀释液900ul，第二至第八管加入标本稀释液500ul。在管中加入2nmol/ml的标准品溶液100ul置于漩涡混合器上混匀后用加样器吸出500ul，移至第二管。如此反复作对倍稀释，从第七管中吸出500ul弃去。第八管为空白对照。
4. 洗涤液：用重蒸水1:20稀释（示例：1ml浓缩洗涤液加入19ml的重蒸水）

四、标本激活方法：

1.将340ul标本稀释液加入到一支1.5ml进口聚丙烯管中,再加20ul血清或血浆或组织标本。

2.加20ul 1 N HCI,盖紧，上下混匀。2－8℃放置60± 2分钟。

3.加20ul 1 N NaOH,盖紧，上下混匀。

4.即用，或放-20/-70℃保存3天。计算结果时乘以稀释倍数20。（注意：不同的标本cGMP的水平可能有较大差异，请根据实际情况灵活掌握稀释度）

5.细胞培养上清2倍稀释(60ul的标本稀释液＋100ul样本＋20ul的1N HCI+20ul的1N NaOH)。

6.尿液直接活化1.4倍稀释（100ul尿液＋20ul的1N HCI+20ul的1N NaOH）

五、检测程序：

1. 加样：每孔各加入标准品或待测样品(已激活)100ul，将反应板充分混匀后置37℃40分钟。
2. 洗板：用洗涤液将反应板充分洗涤4-6次，向滤纸上印干。
3. 每孔加入蒸馏水和抗体工作液各50ul(空白除外)。将反应板充分混匀后置37℃20分钟。
4. 洗板：同前。
5. 每孔加酶标抗体工作液100ul。将反应板置37℃10分钟。
6. 洗板：同前。
7. 每孔加入底物工作液100ul，置37 ℃暗处反应15分钟。
8. 每孔加入100ul终止液混匀。
9. 30分钟内用酶标仪在450nm处测吸光值。 

六、结果计算与判断：

1. 所有OD值建议减除空白值后再行计算。如空白OD低于0.1，也可以直接计算。
2. 以标准品200、100、50、25、12.5、6.25、3.12、0 pmol/ml为横坐标，OD值为纵坐标，使用软件作图，画出标准曲线。
3. 根据样品OD值计算出相应cGMP含量，再乘上稀释倍数即可。软件可以向本公司邮件索取。

七、试剂盒性能：

1.灵敏度：小的cGMP检测浓度小于1.5pmol/ml。

2.特异性：可同时检测重组或天然的人cGMP。不与人其它细胞因子有交叉反应。

3.重复性：板内、板间变异系数均小于8.9％。

八、注意事项：

1.以上标准孔及待测的样品均建议做复孔，每次测定应同时做标准曲线。

2.洗涤过程很关键。洗涤不充分将导致度误差及OD值错误地升高。

3. 检测时所有试剂都要恢复到室温。板条开封后剩余板条要再封好，保持板条干燥。 

4.试剂盒使用超敏TMB溶液，若显色过深会出现絮状物，属正常现象，不影响结果判读。

5.说明书中试剂盒组成为96T的量，48T的量应减半！

6.本试剂盒宜置4^oC冰箱保存。仅用于科研，不能用于临床诊断！